研究：無(wú)證據(jù)表明新冠肺炎患者精液中存在新型冠狀病毒

據(jù)武漢同濟(jì)生殖醫(yī)學(xué)?？漆t(yī)院公眾號(hào)消息，近期由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科潘峰、章小平教授，同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心熊承良教授，同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖健康研究所李紅鋼教授，哥倫比亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院泌尿外科Joseph Alukal教授，康奈爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院男性生殖與顯微外科中心李石華(Philip S.Li)教授和猶他大學(xué)醫(yī)學(xué)院泌尿外科Jingtao Guo和Jemes Hotaling教授研究團(tuán)隊(duì)，共同在美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)權(quán)威期刊Fertility and Sterility發(fā)表題為No evidence of SARS-CoV-2 in semen of males recovering from COVID-19的專題特邀論文。研究發(fā)現(xiàn)在34例確診新冠肺炎(COVID-19)成年男性患者的前瞻性隊(duì)列臨床研究中，在精液中沒(méi)有檢測(cè)到新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)。單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果顯示新冠病毒入侵細(xì)胞受體ACE2和TMPRSS2在人睪丸細(xì)胞中共定位表達(dá)稀疏。研究結(jié)果初步確定SARS-CoV-2不太可能通過(guò)精液或性接觸進(jìn)行傳播。該論文的結(jié)論對(duì)當(dāng)今全球疫情期間所涉及的生殖健康和全球公共衛(wèi)生等問(wèn)題有十分重要的意義。

此前，人們對(duì)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)對(duì)男性生殖功能的影響了解非常有限。在這項(xiàng)前瞻性研究中，作者們對(duì)新冠肺炎(COVID-19)患者精液中進(jìn)行檢測(cè)SARS-CoV-2，同時(shí)結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期在美國(guó)完成的相關(guān)研究報(bào)道的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平觀察ACE2和TMPRSS2在睪丸內(nèi)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。此項(xiàng)研究的目標(biāo)是：1.在確診新冠肺炎(COVID-19)患者精液中是否存在新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染？2.確定人睪丸中ACE2和TMPRSS2的表達(dá)譜，提供病毒侵入并對(duì)男性生殖系統(tǒng)功能影響的機(jī)制。

2019年12月下旬COVID-19在武漢首先報(bào)道，目前已在全球范圍內(nèi)報(bào)告超過(guò)百萬(wàn)例。盡管病毒的傳播主要通過(guò)呼吸道飛沫，但SARS-CoV-2已從血液和糞便中分離出來(lái)，引發(fā)了有關(guān)包括精液在內(nèi)的其他體液中存在病毒以及其他傳播方式的問(wèn)題。與非典肺炎病毒(SARS-CoV)相似，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)可能通過(guò)病毒S蛋白與ACE2之間的相互作用介導(dǎo)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。ACE2在多種器官系統(tǒng)中表達(dá)，包括肺臟II型肺泡細(xì)胞、腸道、心臟、腎臟和睪丸。由TMPRSS2首先啟動(dòng)S蛋白，以增強(qiáng)ACE2介導(dǎo)的病毒侵入。

病毒感染后常累及男性生殖道和睪丸(例如腮腺炎性睪丸炎)。睪丸免疫豁免機(jī)制通?？墒咕哂忻庖咴缘纳臣?xì)胞免受自身免疫系統(tǒng)攻擊，從而為病毒播散提供獨(dú)特環(huán)境。關(guān)于SARS-CoV-2感染后病毒播散和進(jìn)入男性生殖道細(xì)胞的證據(jù)尚不明確。

方法：2020年1月26日至3月2日在武漢確診COVID-19的成年男性患者(18歲-57歲)，在通過(guò)倫理委員會(huì)審查和簽署知情同意后，患者提供射精精液樣本，共招募34名成年男性患者參加本研究。收集精液樣本距COVID-19確診的中位時(shí)間為31天(8天-75天)。

根據(jù)初始臨床癥狀(發(fā)熱、咳嗽，咽痛和呼吸窘迫)、胸部CT和咽拭子樣本進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)確診為新冠肺炎，使用自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)提取SARS-CoV-2病毒核酸。RT-PCR擴(kuò)增并測(cè)試兩個(gè)靶基因，包括開(kāi)放閱讀框1ab(ORF1ab)和核衣殼蛋白(N)。根據(jù)中國(guó)病毒疾病防控所建議，將＜37的循環(huán)閾值定義為陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果，將≥40的循環(huán)閾值定義為陰性測(cè)試結(jié)果。相同的方案用于精液樣品中SARS-CoV-2的檢測(cè)。

為研究ACE2和TMPRSS2在睪丸不同細(xì)胞中的基因表達(dá)水平，進(jìn)行人睪丸單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(scRNA-seq)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)集分析，標(biāo)記主要的睪丸細(xì)胞類型。報(bào)告ACE2和TMPRSS2的單細(xì)胞水平表達(dá)和共定位。

結(jié)果：34例男性患者，平均年齡為37歲(18歲-55歲)，BMI為25.0(18.1-35.5)，其中17例(50％)超重(BMI>25)。在SARS-CoV-2檢測(cè)陽(yáng)性后的一個(gè)月中，未在精液中檢測(cè)出SARS-CoV-2。6例患者(19％)主訴陰囊不適癥狀。

圖中顯示人睪丸細(xì)胞在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平上ACE2和TMPRSS2的表達(dá)情況。采用降維方法(tSNE)顯示人睪丸(6490個(gè)單細(xì)胞)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單細(xì)胞(圖A)，并根據(jù)不同的細(xì)胞類型而呈現(xiàn)不同的著色。通過(guò)將ACE2和TMPRSS2的表達(dá)投影到tSNE圖上，觀察到兩個(gè)基因的表達(dá)量都非常低(圖B)。隨后又檢測(cè)了每個(gè)睪丸細(xì)胞中ACE2和TMPRSS2的共表達(dá)情況(圖C)；6490個(gè)細(xì)胞中只有4個(gè)細(xì)胞顯示兩種基因的共表達(dá)(Pearson correlation value=-0.01)，表明重疊表達(dá)非常有限。

討論：在此項(xiàng)研究中，在近期診斷為COVID-19的成年男性精液中沒(méi)有檢測(cè)到SARS-CoV-2。此外，ACE2和TMPRSS2在人睪丸中表達(dá)稀疏，幾乎沒(méi)有重疊的基因表達(dá)。19％的患者主訴陰囊疼痛，但目前尚不清楚其原因。

人體睪丸內(nèi)免疫豁免的特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，可使原具有免疫原性的生殖細(xì)胞，通過(guò)“血睪屏障”免受自身免疫系統(tǒng)攻擊，任何全身性炎癥反應(yīng)都有可能會(huì)改變這種環(huán)境。很多病毒感染人體后可以在精液中檢測(cè)到病毒，并可導(dǎo)致睪丸炎，例如腮腺炎和寨卡病毒。這些病毒可能對(duì)男性生殖功能產(chǎn)生不利影響。

在此項(xiàng)研究報(bào)道之前，SARS-CoV-2對(duì)男性生殖功能的影響尚不清楚。2006年Xu等報(bào)道了6例因非典肺炎病毒(SARS-CoV)并發(fā)癥死亡的男性尸體解剖后的睪丸病理，發(fā)現(xiàn)在復(fù)雜的炎癥浸潤(rùn)情況下，生精細(xì)胞和精子被廣泛破壞。盡管他們無(wú)法從SARS-CoV分析出基因組特征，但他們推測(cè)SARS-CoV可導(dǎo)致睪丸炎和生殖功能損害。ACE2可能是新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)進(jìn)入細(xì)胞的受體，先前已定位于人睪丸Leydig和Sertoli細(xì)胞。但此項(xiàng)研究中的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)表明ACE2 RNA表達(dá)水平較低。因此，在人睪丸內(nèi)不太可能發(fā)生ACE2介導(dǎo)的SARS-CoV-2進(jìn)入宿主靶細(xì)胞。這表明有必要對(duì)SARS-CoV-2改變睪丸微環(huán)境的其他生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究。

此項(xiàng)研究也有一定的局限性，例如結(jié)果受到樣本量小和選擇偏倚的影響，因?yàn)榇隧?xiàng)研究中COVID-19男性患者更有可能表現(xiàn)出較輕的癥狀。先前的研究表明，較高的病毒載量與更嚴(yán)重的疾病癥狀相關(guān)，未達(dá)到穿過(guò)血睪屏障的病毒血癥或一定的病毒閾值是一種合理的推測(cè)。此外，考慮到有關(guān)從精液標(biāo)本中傳播病毒的生物安全性問(wèn)題，并未進(jìn)行全面的精液分析檢測(cè)。此外，該研究?jī)H在RNA表達(dá)水平上檢測(cè)ACE2和TMPRSS2的表達(dá)。由于基因表達(dá)并不完全能夠反映蛋白質(zhì)的豐度，因此并無(wú)法明確得出這些蛋白質(zhì)缺失的結(jié)論。后續(xù)的研究可以集中在ACE2和TMPRSS2在調(diào)節(jié)睪丸中SARS-CoV-2感染的分布及其作用。

結(jié)論：先前被診斷出COVID-19的成年男性，在最初被感染后約一個(gè)月，精液中沒(méi)有檢測(cè)到SARS-CoV-2。因此，SARS-CoV-2不太可能通過(guò)精液或性接觸進(jìn)行傳播。此外，在先前發(fā)表的高度保真的RNA數(shù)據(jù)集中，ACE2和TMPRSS2共表達(dá)水平很低，表明SARS-CoV-2可能無(wú)法通過(guò)ACE2/TMPRSS2介導(dǎo)機(jī)制進(jìn)入睪丸細(xì)胞。需要進(jìn)一步研究了解SARS-CoV-2對(duì)男性生殖功能的遠(yuǎn)期影響。

國(guó)際著名生殖醫(yī)學(xué)專家、斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心男性生殖外科主任Michael L.Eisenberg教授，同期發(fā)表了題為“新型冠狀病毒(COVID-19)與男性生殖健康”的評(píng)論，對(duì)這篇文章的重要價(jià)值給予充分肯定。

隨著COVID-19在全球范圍流行蔓延，科學(xué)界持續(xù)進(jìn)行SARS-CoV-2病毒病理生理學(xué)研究，揭示其傳播性、易感性并為治療提供指導(dǎo)。呼吸系統(tǒng)感染導(dǎo)致的癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促等。在感染者的鼻腔分泌物、痰液、糞便中可檢測(cè)到具有高度傳染性的病毒，在血液中很少(1％)，在尿液中則未檢測(cè)到。雖然已經(jīng)報(bào)道COVID-19患者的心臟、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，但新冠狀病毒對(duì)生殖功能的影響仍然未知。有報(bào)道顯示男性患者有較高的感染率、發(fā)病率和死亡率，將學(xué)者們的注意力轉(zhuǎn)移到了潛在的男性基因易感性?？茖W(xué)家已確定冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑，即通過(guò)S蛋白附著在宿主ACE2受體上，并由TMPRSS2來(lái)啟動(dòng)S蛋白，已知這兩者都存在于睪丸中，由此引起對(duì)新冠狀病毒可能導(dǎo)致睪丸感染和性傳播的關(guān)注。

在此項(xiàng)研究中，Pan及其同事針對(duì)COVID-19可能涉及睪丸的相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行探討，在34名男性精液中并未發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2，病毒不會(huì)（或幾乎不可能）通過(guò)精液傳播，該項(xiàng)研究結(jié)果令人寬慰。需要注意的是，研究中男性通常為急性感染后幾周進(jìn)行檢測(cè)，一些患者只有輕微癥狀，可以想象在更早的時(shí)間點(diǎn)或更高的病毒負(fù)荷量可能會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果。但是考慮到精子生成和輸送過(guò)程的正常周期，這種可能性似乎較小。

考慮到SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞的已知機(jī)制，以及對(duì)ACE和TMPRSS2蛋白雙重表達(dá)的要求，作者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析顯示，在6490個(gè)睪丸細(xì)胞中只有4個(gè)細(xì)胞(<0.1％)含兩種蛋白質(zhì)RNA。因此，SARS-CoV-2似乎不可能如假設(shè)中那樣進(jìn)入睪丸中的任何細(xì)胞(如生精細(xì)胞、Leydig細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞等)。

作者同時(shí)報(bào)告了另一種臨床表現(xiàn)，即在COVID-19感染患者中，17.6％(6/34)的男性伴隨陰囊不適。COVID-19主要集中于嚴(yán)重的全身或呼吸系統(tǒng)癥狀，提示在未來(lái)的篩查中應(yīng)注意這些臨床表現(xiàn)，并進(jìn)一步了解其病理生理以及對(duì)生殖的影響。本報(bào)告中由于客觀原因無(wú)法評(píng)估參與者精液質(zhì)量參數(shù)的變化，因此仍然未知病毒是否會(huì)影響受感染男性的生育力。先前其他發(fā)熱疾病的數(shù)據(jù)表明，急性疾病和體溫升高(如發(fā)熱)可暫時(shí)影響精子發(fā)生，COVID-19是否遵循此種模式，仍有待闡明。此外，由于新冠狀病毒感染者中80％以上為無(wú)癥狀感染者，對(duì)這些人群的生殖功能是否有影響尚不清楚。

本次研究報(bào)告是SARS-CoV-2與人類生育力之間關(guān)系的首次探索。輔助/非輔助生殖女性在COVID-19急性感染期或康復(fù)期受到如何影響及其預(yù)后仍有待研究。鑒于受當(dāng)前全球疫情的影響，病毒可能會(huì)持續(xù)流行一段時(shí)間，全球每年將有超過(guò)1億嬰兒出生，應(yīng)進(jìn)一步研究SARS-CoV-2對(duì)生殖功能的影響。